随着精准医疗的飞速发展，细胞免疫治疗（如CAR – T 细胞疗法）和基因治疗已成为攻克恶性肿瘤、遗传性疾病等难治性疾病的重要手段。在这些前沿治疗技术中，高纯度质粒DNA 作为关键的载体或治疗性核酸分子，其质量直接决定了治疗的安全性和有效性。然而，在利用大肠杆菌（E.coli）进行质粒大规模生产的过程中，即使经过严格的纯化工艺，仍可能残留E.coli 来源的RNA。这些残留RNA 若未被有效检测和去除，将给细胞免疫治疗和基因治疗产品带来严重隐患，因此，E.coli 残留RNA 检测成为高纯度质粒生产质量控制体系中不可或缺的关键环节。
一、高纯度质粒在细胞免疫治疗与基因治疗中的核心地位
在细胞免疫治疗领域，以CAR – T 细胞疗法为例，科学家需要将编码嵌合抗原受体（CAR）的质粒DNA 导入患者自体T 细胞中，使T 细胞具备特异性识别并杀伤肿瘤细胞的能力。此时，质粒DNA 的纯度至关重要，任何杂质的存在都可能干扰T 细胞的转染效率，影响CAR 的正确表达，进而降低治疗效果。在基因治疗中，质粒DNA 常作为载体将治疗性基因递送至患者体内靶细胞，以修复缺陷基因或表达治疗性蛋白。若质粒中含有杂质，不仅可能导致基因递送失败，还可能引发一系列安全问题。
高纯度质粒的生产通常以E.coli 为宿主菌，因为E.coli 具有繁殖速度快、培养成本低、易于基因工程操作等优势，能够高效大量地合成目标质粒。但E.coli 自身含有大量的RNA 分子，包括核糖体RNA（rRNA）、信使RNA（mRNA）和转运RNA（tRNA）等。在质粒提取和纯化过程中，虽然会采用碱裂解法、柱层析法等多种工艺去除RNA，但由于RNA 与质粒DNA 在分子大小、电荷性质等方面存在一定相似性，难以通过常规纯化手段完全去除，导致最终产品中可能残留E.coli RNA。
二、E.coli 残留RNA 对细胞免疫治疗与基因治疗产品的潜在危害
（一）影响治疗效果
残留的E.coli RNA 可能与质粒DNA 竞争转染试剂或转染通道，降低质粒DNA 进入靶细胞的效率。在细胞免疫治疗中，若CAR 编码质粒的转染效率下降，会导致表达CAR 的T 细胞比例降低，进而削弱T 细胞对肿瘤细胞的杀伤能力；在基因治疗中，治疗性基因质粒转染效率降低会导致靶细胞中治疗性基因的表达量不足，无法达到预期的治疗效果，甚至可能使治疗失败。
例如，在某CAR – T 细胞疗法的临床前研究中，研究人员发现当质粒中E.coli 残留RNA 含量超过一定阈值时，CAR – T 细胞的转染效率从80% 以上降至50% 以下，且最终制备的CAR – T 细胞对肿瘤细胞的杀伤活性也显著下降，体外杀伤实验中肿瘤细胞的存活率提高了30% 以上。
（二）引发免疫原性反应
E.coli RNA中含有大量的免疫刺激序列，如Toll 样受体（TLR）配体。当含有残留E.coli RNA 的质粒产品进入人体后，这些免疫刺激序列会被人体免疫系统中的免疫细胞（如巨噬细胞、树突状细胞）识别，激活TLR 信号通路，引发过度的免疫反应。在细胞免疫治疗中，过度的免疫反应可能导致细胞因子释放综合征（CRS），患者会出现高热、低血压、呼吸困难等症状，严重时甚至会危及生命；在基因治疗中，过度免疫反应可能导致局部组织炎症、水肿，还可能破坏靶细胞，影响治疗基因的持续表达。
已有研究表明，将含有E.coli 残留RNA 的质粒通过静脉注射到小鼠体内后，小鼠血液中的肿瘤坏死因子- α（TNF – α）、白细胞介素- 6（IL – 6）等细胞因子水平在24 小时内显著升高，最高可达正常水平的10 – 20 倍，部分小鼠出现了明显的体重下降、精神萎靡等症状，病理切片显示小鼠肝脏、脾脏等器官出现了炎症细胞浸润。
（三）干扰质量控制与产品稳定性
残留的E.coli RNA 还可能干扰质粒产品的质量控制检测。在对质粒浓度、纯度进行检测时，RNA 的存在可能导致紫外分光光度法检测的A260/A280 比值偏离正常范围，误判质粒的纯度；在琼脂糖凝胶电泳检测中，RNA 可能与质粒DNA 形成杂带，影响对质粒完整性和纯度的准确判断，给质量控制工作带来困难。
此外，RNA 分子稳定性较差，在储存和运输过程中容易发生降解，产生的RNA 片段可能与质粒DNA 发生相互作用，影响质粒的稳定性。同时，RNA 的降解产物还可能改变质粒溶液的性质，如pH 值、渗透压等，进一步影响质粒产品的稳定性，缩短产品的保质期。
三、E.coli 残留RNA 检测在高纯度质粒生产质量控制中的重要性
（一）保障患者用药安全
通过严格的E.coli 残留RNA 检测，能够确保最终用于临床治疗的质粒产品中RNA 残留量符合相关法规和质量标准要求，避免因RNA 残留引发的免疫原性反应和其他安全风险，保障患者的用药安全。目前，国内外相关监管机构（如美国FDA、中国NMPA）已对细胞免疫治疗和基因治疗产品中E.coli 残留RNA 的含量设定了严格的限值标准，只有通过检测确认RNA 残留量低于限值的产品才能进入临床应用。
例如，中国NMPA 发布的《人基因治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》中明确规定，基因治疗产品中宿主菌（如E.coli）残留RNA 的含量应低于10ng / 剂量；美国FDA 在相关指导文件中也对细胞免疫治疗产品中E.coli 残留杂质（包括RNA）的控制提出了严格要求，要求企业建立有效的检测方法和质量控制体系，确保产品的安全性。
（二）确保治疗效果的稳定性和可靠性
E.coli残留RNA 检测能够帮助生产企业及时发现质粒纯化过程中存在的问题，优化纯化工艺，降低RNA 残留量，提高质粒的转染效率和治疗效果的稳定性。通过对每一批次质粒产品进行RNA 残留检测，能够建立产品质量的追溯体系，确保不同批次产品的质量一致性，避免因批次间RNA 残留量差异导致治疗效果波动，为临床治疗提供稳定、可靠的产品保障。
在实际生产中，生产企业可以通过定期检测E.coli 残留RNA 的含量，分析不同纯化工艺参数（如洗脱缓冲液浓度、层析柱流速等）对RNA 残留量的影响，进而优化纯化工艺。例如，某生产企业通过调整层析柱的洗脱缓冲液pH 值，将质粒中E.coli 残留RNA 的含量从20ng/mg 降至5ng/mg 以下，显著提高了质粒的转染效率和治疗效果的稳定性。
（三）符合法规要求与行业标准
随着细胞免疫治疗和基因治疗行业的不断发展，相关法规和行业标准日益完善，对质粒产品的质量控制要求也越来越高。E.coli 残留RNA 检测作为质粒生产质量控制的重要组成部分，是生产企业符合法规要求和行业标准的必要手段。只有建立完善的RNA 残留检测方法和质量控制体系，才能通过监管机构的审核和认证，获得产品的上市许可。
同时，严格的E.coli 残留RNA 检测也有助于提升企业的市场竞争力。在当前竞争激烈的细胞免疫治疗和基因治疗市场中，产品质量是企业生存和发展的关键。通过确保质粒产品中E.coli 残留RNA 含量符合高标准要求，能够提高产品的可信度和市场认可度，为企业赢得更多的市场份额。
四、常用的E.coli 残留RNA 检测方法及其应用
目前，用于检测E.coli 残留RNA 的方法主要包括实时定量聚合酶链反应（qPCR）法、逆转录- 实时定量聚合酶链反应（RT – qPCR）法、杂交法以及基于核酸扩增的其他检测技术等。
R RT – qPCR法是在qPCR 法的基础上增加了逆转录步骤，首先将E.coli RNA 逆转录为cDNA，然后再进行qPCR 扩增和检测。该方法适用于检测E.coli mRNA 等不稳定的RNA 分子，能够提高检测的灵敏度和特异性。同时，RT – qPCR 法还可以通过设计不同的引物和探针，实现对不同类型E.coli RNA 的分别检测，为分析RNA 残留的来源和性质提供更多信息。qPCR 法具有灵敏度高、特异性强、检测速度快、重复性好等优点，能够检测到pg 级甚至fg 级的E.coli RNA，适用于高纯度质粒中低含量E.coli 残留RNA 的检测。
